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檢測可生育女性和反復生育失敗患者圍著床期子宮內膜自然殺傷細胞百分比:建立可參考的范圍體系

2018-04-10 17:23 來源: 中國婦產科網 作者: 馬寧,肖豫 瀏覽量: 9237

【摘要】

      研究背景:子宮自然殺傷(uNK)細胞是目前圍著床期子宮內膜的主要白細胞。以往研究發現,與生育能力正常的女性相比,uNK細胞存在比率在反復生育失敗的女性中存在爭議。目的:比較uNK細胞百分比在反復生育失敗和生育能力正常女性中的不同。設計:這是在大學附屬醫院進行的一項回顧性研究。共有來自3所大學研究中心的215名女性參與,其中包括97名復發性流產(RM)的女性、34名反復種植失?。≧IF)的女性和84名生育能力正常的女性。在自然排卵周期黃體生成素激增(LH峰)后7天進行子宮內膜活檢。子宮內膜切片標準化流程進行CD56免疫組化染色和細胞計數。結果由染色陽性的uNK細胞/基質細胞百分比表示。結果:自然周期排卵正常的中國婦女uNK細胞百分比中位數為2.5%(0.9~5.3%)。使用5th為下限和95th為上限,確定uNK細胞百分比參考范圍是1.2-4.5%??傮w來說,RM組子宮自然殺傷細胞百分比明顯高于正常對照組(RM:中位數為3.2%(0.6-8.8 %);RIF:中位數為3.1%(0.8-8.3 %))。然而,這兩組中有一部分(RM組中16/97;RIF組中6/34)的uNK細胞百分比低于正常對照組。結論:在這項研究中,建立了可生育女性uNK細胞百分比的參考范圍。反復生育失敗女性uNK細胞百分比高于或低于參考范圍。

   關鍵詞:可生育女性,反復種植失敗,復發性流產,參考范圍,子宮自然殺傷細胞 

      子宮自然殺傷(uNK)細胞是目前在子宮內膜的主要白細胞,這些子宮內膜顆粒細胞的表型是CD56+ CD16-, 而在外周血中CD56- CD16+自然殺傷(NK)細胞為主要亞群。 CD56+ NK細胞數量隨著整個月經周期變化,分泌中期也就是LH峰6-7天后有一個激增,這個時期通常被認為是胚胎種植的開始。研究顯示反復種植失敗的女性圍種植窗期子宮內膜的uNK細胞比率是不同的。應用免疫組化研究顯示,CD56+NK細胞在復發性流產和IVF反復種植失敗患者的圍著窗期子宮內膜中表達升高。然而,在反復性流產女性中uNK細胞測量對預后價值尚未得到證實。此外,盡管在可生育女性uNK細胞正常參考范圍尚未確立,但由于種植失敗尋求uNK細胞檢測的婦女呈增長趨勢。本研究的目的是采用最近公布的方法學、精確的子宮內膜活檢時間(LH+7),來確定uNK細胞百分比參考值范圍,并和反復生育失敗的女性相比較。 

一、 材料與方法

研究對象來自三個醫療中心的患者,如表1:

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PWH為中國人,正常生育女性23人,復發性流產97人,反復種植失敗34人;SZH為中國人,包括正常生育女性49例;STH為白種人,包括可生育女性12人。

在這項研究中,所有受試者每日尿試紙測試,從月經周期9天起確定的LH峰(排卵),時間精確到LH峰后7天,也就是圍著床期子宮內膜活檢日,所有活檢使用Pipelle采樣得到。一抗采用鼠抗人單克隆抗體的主要抗-CD56 (NCL-CD56-504; Novocastra Laboratories, Newcastle, United Kingdom)進行免疫組化CD56染色。細胞計數的方法采用根據約定和標準化協議的一項多中心工作組制定的方法,旨在減少結果之間的差異 。uNK細胞數(CD56 +染色)和間質細胞(CD56-染色)使用人工圖像檢測,結果表示為總基質細胞的百分比。 (圖1)

       統計學分析采用Shapiro Wilk檢驗,所有結果均為正態分布數據,用均數±標準差或者中位數表示。CD56+細胞比例5%-95%結果表示生育的下限和上限,作為參考范圍。非參數(Mann Whitney U)試驗是用來比較女性CD56+細胞的百分比。

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二、 結果

1. 入組患者

所有參與者都有規律的月經周期;在正??缮M,中國育齡婦女的平均年齡為29歲(22-38),白人女性的平均年齡為36歲(30-42,);可生育組沒有一次自發性流產史 ;在復發性流產組,流產次數平均為3(3-5),平均年齡為35歲(26-40);在反復種植失敗組,失敗的IVF周期平均為4(3-6),平均年齡為37歲(32-40)。 

 

2. uNK細胞在可生育女性中的百分比

所有入組女性均有自然排卵的月經周期,本研究使用5th- 95th的可信區間作為可生育女性圍著床期子宮內膜uNK細胞的正常范圍,72例中國可生育女性uNK細胞均數的百分比為2.5%(0.9-5.3 %),12例白種婦女uNK細胞均數的百分比為3.3%(1.1-5.3 %)。中國人和白種人之間沒有顯著差異。

 

3. uNK細胞在反復生育失敗女性中的百分比

uNK細胞百分比均數在復發性流產組的婦女為3.2%(0.6-8.8 %),并在反復種植失敗的女性為3.1%(0.8-8.3 %) ;相比于正常人的平均水平(2.5%),在復發性流產組的百分比是升高的(P = 0.42),反復種植失敗也是升高的(P = 0.48) 。

 

4. uNK細胞在反復種植失敗女性中的百分比

使用5th (1.2%)為下限和95th (4.5%)為上限,定義uNK細胞百分比參考范圍:復發性流產的婦女60/97(62%)在參考范圍內,21位女性高于上限,16位女性在低于下限 ;反復種植失敗的婦女18/34(53%)在參考范圍內,10位女性高于上限,6位女性低于下限。 

 

三、討論

在這項研究中,我們建立了中國可生育女性圍著窗期子宮內膜uNK細胞百分比5th - 95th 的可信區間參考范圍,我們也觀察到,反復種植失敗的女性uNK細胞百分比升高,同時有62%的復發性流產的患者和53%種植失敗的患者在此參考范圍之內。 

1. uNK細胞的檢測方法

缺乏對NK細胞的百分比測量的標準方法,是了解這些細胞在妊娠中的作用中的障礙 ,然而一個工作組最近發布的方法,解決了這一問題。采用標準化方法定時采樣、處理標本以及計算。在本次實驗中,我們采用了這一新方法,應用分析顯示可接受的變異水平。在目前的研究中,對自然殺傷細胞的測量結果表示為一個百分比(CD56 + /基質細胞數)而不是uNK細胞每視野的絕對數量,在uNK細胞測量標準化建議中也是推薦用uNK細胞百分比表示??紤]到子宮內膜在種植窗期,內膜的形態和功能以及uNK細胞數量隨著月經周期變化迅速,所以內膜活檢的時間精確是十分重要的。本次實驗,所有婦女活檢進行精確定時在LH峰7日后。 

2. uNK細胞的參考范圍

盡管許多關于自然殺傷細胞的數量的文章報道,但都缺乏來自可生育女性的足夠數據,我們的研究表明,在自然排卵周期可生育中國女性圍種植窗期子宮內膜uNK細胞百分比參考值范圍可定義為1.2% - 4.5%,然而,這些發現可能不適用于控制性卵巢周期或冷凍胚胎移植周期。據我們所知,在我們的研究中,中國可生育女性數量設計(N = 72)是目前已發表的最大群體,在這項研究中,我們選擇使用 5th-95th確定參考范圍,4.5% uNK細胞的上限與Quenby等人報道相似。據我們所知,除了我們的研究,以往的研究都將焦點集中在參考范圍的上限,對下限的忽視對生育是不利的?;谖覀兲岢龅膮⒖挤秶?,我們定義了一個下限1.2%,發現約有16%(16 / 97)復發性流產的婦女和18%左右(6 / 34)反復植入失敗婦女uNK細胞百分比低于此值,這種結果與臨床相關性需要進一步調整。 

3. uNK細胞和復發性流產及反復種植失敗 

一些研究表明,uNK細胞百分比在復發性流產的育齡婦女和正??缮灾g無顯著性差異,而絕大多數的研究發現復發性流產女性中的uNK細胞百分比是增高的。這項研究中,這是與許多早期的研究結果一致,表明uNK細胞百分比均數在反復流產的婦女中增加 ,約22%(21 / 97)的復發性流產的女性有較高uNK百分比,高于我們界定的上限。早期的研究發現,在反復植入失敗的年輕女性uNK細胞比例沒有增加 ,然而,其他一些研究報告,IVF后反復種植失敗子宮內膜uNK細胞百分比增加。在這項研究中,我們還發現uNK細胞在反復植入失敗的婦女中顯著增加,大約有29%(10/34)婦女uNK細胞百分比高于上限。 

4. 種族間的比較

較早的一項研究比較了中國和白種人群的外周NK細胞,發現中國女性外周血NK細胞數量高于白種婦女 ,然而據我們所知,還沒有任何研究報告對各種族uNK細胞變化有明確的結論。 在這項研究中,中國人與白種人可生育女性uNK細胞的百分比的中位數和范圍是相似的,建立參考值范圍可適用于兩人群,然而,在這項研究中,白種婦女的數量非常小,需要更大的樣本量來證實這一觀察結果。 

5. 本研究的優勢

有幾項優勢 第一,取標本的時間是精確的;第二,uNK細胞的計數選用的是標準方式;第三,招募了72名可生育中國婦女以建立參考范圍,這比以前的研究群體要大得多。 

 

四、結論

在這項研究中,我們建立了在圍著床期LH + 7育齡婦女子宮內膜uNK細胞百分比參考范圍,使用這個參考值,發現大多數反復種植失敗的女性uNK細胞的百分比高于或低于此參考范圍 ,我們發現,38%復發性流產的婦女,47%反復植入失敗女性uNK細胞計數百分比在參考范圍外,大多數高于此范圍,小部分低于此范圍。


審校:

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      馬寧,1996年畢業于首都醫科大學,2003年師從于夏恩蘭教授學習,2009年赴英國謝菲爾德大學附屬醫院訪問,師從于生殖手術專家TC Li教授,首都醫科大學附屬復興醫院宮腔鏡中心主任醫師。2010年取得國家婦科內鏡培訓基地第一批婦科內鏡教師資格,宮腔鏡專業特長,長期從事宮腔鏡手術、教學與科研工作。參與編寫《宮腔鏡學及圖譜》(第三版)、《婦科腹腔鏡手術操作及實例精選演示》、《婦科宮腔鏡手術操作及實例精選演示》、《婦科內鏡》(第二版),參譯《宮腔鏡診斷及手術》,并參與出版了宮腹腔鏡手術教學光盤等多部專著。


譯者:

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      肖豫,畢業于北京大學醫學部,博士學位。曾赴英國約克郡皇家哈勒姆醫院婦科生殖內鏡研修,現為北京復興醫院宮腔鏡中心副主任醫師。從事婦產科臨床、教學及科研工作10余年,在婦科生殖方面積累了豐富的臨床經驗。

      參與編譯多部宮腔鏡著作,主持包括國自然基金在內多項科研項目,有20余篇論文在SCI和國家核心期刊發表。

      現任:北京醫學會生殖醫學分會青年委員,中國婦幼協會微創分會宮腔鏡學組青年委員秘書,中國醫藥教育協會婦科專委會委員。


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