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人乳頭瘤病毒檢測方法及其臨床意義簡述

2018-11-12 11:24 來源: 中國婦產科網 作者: 趙澄泉 瀏覽量: 16790

楊懷濤1, 李娟2, 趙澄泉3

1. 美國Conemaugh醫學中心 2. 濟南市婦幼保健院 3. 美國匹茲堡醫療中心

人乳頭狀瘤病毒(HPV)是宮頸癌的主要致病因素。已知的HPV有至少150多種,其中至少40種可通過性接觸和肛門生殖器區感染而傳播。HPV根據致癌的風險性高低分為低危型lrHPV(引起濕疣)或高危型hrHPV(致癌) 。高危型hrHPV可引起宮頸上皮內瘤變(CIN)、陰道上皮內瘤變(VAIN)、外陰上皮內瘤變(VIN)、陰莖上皮內瘤變(PIN)和肛門上皮內瘤變 (AIN),以及相應的浸潤性癌。

HPV不同于其他DNA病毒,不能由傳統的細胞培養方法檢查。經典的直接病毒學診斷技術如電鏡和免疫組織化學,由于有限的敏感性和特異性,也不能常規用于HPV檢測??笻PV抗體的血清學檢測由于分析準確性差而尚未用于常規的臨床診斷。因此,所有商業化的HPV檢測方法都是檢測臨床樣本中HPV核酸。盡管近二十年許多HPV核酸檢測方法被成功廣泛地應用于實驗室研究,但大多數卻沒有被美國食品藥品監督管理局(FDA)批準用于臨床檢測。

目前美國經FDA批準用于檢測高危型HPV的方法有7種。其中包括HPV雜交捕獲2代(HC2)技術,Cervista高危型HPV檢測及Cervista HPV16/18測定法,COBAS4800HPVDNAPCR檢測法, 針對檢測HPVE6和E7mRNA的Aptima HPV方法及Aptima HPV16、18/45基因分型方法,新近批準的BDOnclarity?HPVAssay檢測技術。我們將簡要討論這些檢測方法包括設計、臨床指征、檢測的高危型HPV類型、臨床驗證效果、以及潛在的問題和解決方法。本文HPV指高危型HPV。

一、HPV檢測方法簡介

1、HC2HPVDNA檢測技術該技術是1997年由Digene公司開發,1999年FDA批準用于臨床檢測經細胞學診斷為“意義不明的不典型鱗狀上皮細胞(ASC-US)”患者的反饋性檢驗 。2003年3月30日,FDA批準該方法用于30歲以上女性的常規宮頸Pap細胞學和HPV聯合檢驗” 。HC2 HPV檢測技術是診斷HPV最早應用的方法,其它的HPV檢測方法一般都要求在臨床驗證過程中與HC2方法做對照比較,具有與HC2相似的敏感性和特異性。

HC2HPV檢測方法是一種體外核酸雜交方法,該方法使用微孔板發光信號定量檢測13種高危型HPVDNA檢測(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68)并將信號放大。含有靶DNA的宮頸細胞樣本與特異性高危型HPVRNA探針雞尾酒雜交,RNA探針和欲檢測的高危型HPVDNA合成的雜交物被捕獲到微孔板上。該板上已預先涂上針對RNA-DNA雜交的特異性抗體。在堿性磷酸酶標記的抗體與固定的雜交體結合后,該信號被化學發光底物檢出。多個標記的抗體與每個捕獲的雜交體結合導致大量的信號放大,發出的光信號在光度計上被測出相對光單位(RLU), 以其強度表示臨床宮頸標本欲檢測的高危型HPVDNA存在與否。

等于或大于截斷值(CO)的RLU表示存在高危型HPVDNA序列。為了提高工作量,HC2檢測快速捕獲系統 (Qiagen公司)在過去的幾年已被使用。

使用這個系統,一個檢測人員在8h內可以處理患者標本達352例,包括其間自動操作3.5小時。

HC2HPVDNA檢測要求標本用HC2DNA收集裝置或HC宮頸采樣器(宮頸刷),標本運輸使用Digene(Qiagen)公司樣本運輸培養液或Cytyc PreservCyt瓶。標本可以存放在室溫下長達2周,便于送至實驗室。兩周后,標本在2-8℃下可以繼續保持1周。如果在標本收集后3周內還不能進行檢測,則標本可以保存于負20℃ ,至最多3個月。保存在Cytyc PreservCyt保存液里的標本不僅可進行薄層液基涂片檢查, 也可用于HC2HPV的檢測,如進行后者檢測則需要4ml的PreservCyt保存液。PreservCyt保存液保存的標本可以在2-30℃下保存到3個月。

一般來說,PreservCyt保存液保存的標本不可以冷凍保存。HC2方法目前存在的主要問題是分析不夠準確,這是由于其雞尾酒探針與其他HPV (11、53、54、55、66、MM4、MM7、MM8或MM9、39)發生交叉反應 。另外,該方法缺乏內對照來評價標本滿意度或可能存在的干擾物等。研究發現HC2檢測法存在5%的假陽性率。 

 2、Cervista高危型HPV檢測技術Hologic公司研發的Cervista高危型HPVDNA檢測技術于2009年3月12日經FDA批準。Cervista檢測用于:

(1)宮頸細胞學為ASC-US患者的反饋性HPV檢測;

(2) 30歲及以上婦女宮頸細胞學輔助檢測是否存在高危型HPV。

FDA批準Cervista檢測技術適用于ThinPrep PreservCyt保存液保存的標本。Cervista HPV檢測技術包括兩種檢測方法:Cervista高危型HPV檢測和Cervista HPV16和18的檢測。它可定性檢測宮頸標本中是否存在14種高危型HPV類型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)。高危型HPV不能確定特異的HPV基因型。

Cervista高危型HPV檢測技術使用的方法是Invader化學法。它是一種檢測特定的核酸序列的信號放大方法。這種方法使用兩種類型的等溫反應:初次反應發生在靶DNA序列上,第二次反應產生熒光信號。在初次反應中,有兩種類型的序列特異性寡核苷酸:寡核苷酸探針和Invader寡核苷酸。它們與DNA靶向序列結合。

當這些寡核苷酸在目的序列上至少有一個堿基對重疊時就形成了侵襲性結構。裂解酶在重疊位置裂解探針的5部分。過剩的探針在快速的循環啟動和關閉靶序列中每個靶序列產生許多裂解的5端片段。這些片段與通用的發夾熒光共振能量轉移器(FRET) 寡核苷酸結合,產生另一個侵襲性結構,并可被裂解酶作為底物而識別。在酶裂解熒光團和淬滅分子之間的FRET寡核苷酸后,熒光信號便在循環啟動和關閉靶序列中時產生。

這種Cervista高危型HPV檢測技術的試劑是以3種寡核苷酸混合物來提供的,設有包括陽性和陰性對照在內的內對照和外對照,每次檢測中必須進行對照。當陽性和陰性對照結果正確,樣本結果才有效。與人組蛋白2基因 (H2be,HIST2H2BE) 結合的寡核苷酸也存在并可作為內對照。通過在探針上使用2套不同的5一端序列和兩個分別標記不同熒光(FAM和紅色)的FRET寡核苷酸,高危型HPV檢測技術能夠在一個孔中同時檢測HPV的DNA序列和HIST2H2BE。

陽性結果表明DNA樣本中14種高危型HPV至少存在1種。陽性結果由FAM熒光信號代表,高于經驗得出的截斷值;陰性結果則低于經驗得出的截斷值。任何樣本的最終陽性、陰性或不確定性結果是根據信噪比而產生 的,這個比值被稱作為FOZ(Fold-Over-Zero)。 

宮頸標本應收集在ThinPrep巴氏涂片系統中的 PreservCyt保存液內,使用宮頸刷/匙采集標本。對于Cervista高危型HPV檢測,官頸標本置于PreservCyt保存液中,20~30℃中保存可長達18周。Cervista高危型HPV檢測技術的局限性是可能與其他類型的HPV如HPV67和70發生交叉反應,從而產生假陽性結果。

 3、CervistaHPV16/18檢測技術Hologic公司研發的Cervista HPV 16和18檢測技術是一種體外的定性檢測宮頸標本中HPV16和18 DNA的基因分型診斷方法。 Cervista HPV16和18檢測使用與高危型HPV檢測同樣的技術:Invader化學法。在初次反應中,用于該檢測技術的寡核苷酸探針與高危型HPV16和高危型HPV18的DNA靶序列結合。與Cervista高危HPV檢測方法同時被FDA批準應用(2009年3月12日) 。

美國陰道鏡和宮頸病理學會(ASCCP)建議對細胞學陰性、高危型HPV陽性的30歲及以上婦女進行HPV16和18檢測。如果HPV16和18陽性,可直接轉診陰道鏡檢查。HPV16和18檢測技術的局限性是其交叉反應和假陰性。該方法可與高水平的高危型HPV31發生交叉反應。非常低的HPV感染或樣本差誤可導致假陰性結果。

 4、Cobas4800HPV檢測技術

Cobas4800HPV檢測技術是羅氏公司于2009年11月在歐洲市場推出的。2011年4月,美國FDA批準Cobas4800HPV技術用于宮頸標本的檢測。它是使用熒光信號檢測通過即時PCR方法擴增的核酸。4800HPV檢測技術是通過Cobas4800系統進行操作的,該系統由兩個獨立儀器組成:Cobasz480和Cobas X 480分析儀。4800HPV檢測技術由FDA批準可以使用ThinPrep PreservCyt或者SurePath? Preservative Fluid保存液采集的宮頸標本收集。

Cobas4800系統中的軟件可整合樣品制備、擴增、檢測和數據管理。該軟件對每個樣品都有兩個不同的檢測選項:一種是對所有14種高危型HPV類型進行混合檢測,另一種是額外加上HPV16和18型檢測。Cobas HPV檢測使用的是通過PCR擴增的目的DNA,隨后進行核酸雜交一次性分析14種高危型HPV。

該檢測方法最大優點可以同時HPV16/18基因分型,也可檢測其余的12種高危型HPV (31、33、35、39、 45、51、52、56、58、59、66、68)。Cobas HPV檢測有4種指征: 

(1) 21歲及以上ASC—US患者的反饋性HPV檢查;

(2)21歲及以上ASC-US患者,評價其是否存在高危型HPV16和18型感染;

(3) 30歲及以上婦女宮頸細胞學的輔助檢查,檢測是否存在高危型HPV類型;

(4) 30歲及以上婦女,評價其是否存在高危型HPV16和18型感染。

2014年4月25日FDA批準Cobas HPV可用子宮頸癌一線篩查,這是美國FDA第一個批準可用一線篩查的HPV檢查。但4年后的今天,仍然很少有人用HPV檢查作為一線篩查。

Cobas HPV檢測技術有質量控制 (每次運行時有內對照:13-球蛋白,陽性和陰性對照以保證實驗結果可靠)、高流量(Cobas 4800系統被設計一天可處理樣本達280個)、自動化(僅有裝卸微孔板是手工操作)和兼容LIS系統(Cobas4800系統可以連接到實驗室信息系統)等優點。有關Cobas4800HPV檢測分析及其臨床效果的文獻有限。該檢測方法的臨床敏感性和特異性與HC2相當,實驗室內和實驗室間重復性高,數據表明該測定法完全滿足國際指南要求,可作為臨床有效的HPV檢查方法 。

 5、Aptima HPV檢測技術 

AptimaHPV檢測技術由Gen-Probe公司研發,是于2011年10月28日由FDA批準的HPV檢測方法。FDA批準該檢測方法可使用Gen-Probe Tigris,是一的全自動分子診斷檢測系統。Gen-Probe2012年8月被Hologic收購。AptimaHPV檢測技術是一種轉錄介導的、以擴增為基礎的檢測方法,可檢測14種高危型HPV (16、 18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)的E6/E7mRNA轉錄子,該方法不能區分14種高危型HPV的具體類型。

Aptima檢測技術包括3個主要步驟:低聚物靶向捕獲、轉錄介導擴增 (TMA)的靶向擴增、雜交保護實驗(HPA)和通過對擴增產物進行檢測分析。當標本細胞溶解后,目的mRNA被釋放出來并由帶有磁性微粒的低聚物捕獲。捕獲低聚物含有高危型HPVmRNA靶分子特定區域的互補序列,在雜交反應過程中,二者結合形成捕獲低聚物:靶復合物。當靶向捕獲完成后,高危型HPVmRNA通過TMA而擴增。TMA反應使用兩種酶:MMV逆轉錄酶和T7RNA多聚酶。MMLV逆轉錄酶被用于產生靶向高危型HPV mRNA序列的一個DNA拷貝,其中包含T7RNA多聚酶的啟動子序列。

隨后,T7RNA多聚酶從DNA拷貝模板中產生多拷貝的RNA擴增子。擴增子的檢測是通過HPA完成。HPA使用化學發光標記的單鏈核酸探針,該探針對擴增子互補。從標記的RNA:DNA雜交體發射出來的光被測量成光子信號,并報告為相對光單位。內對照被作為質量控制。該檢測方法的軟件自動確定分析測試結果。通過信號值/截止值(S/CO)確定,測試結果可能是陰性、陽性或無效。

宮頸標本可收集在含有PreservCyt溶液的ThinPrep Pap 瓶或Aptima宮頸標本采集運輸管中。如果標本儲存于PreservCyt溶液中,在運輸前PreservCyt液基巴氏標本應儲存于2—8 C,溫度達到30℃ 則不能超過30 天。如果收集在PreservCyt保存液中的標本被轉移到Aptima樣品運輸管中, 在2~30℃它可儲存長達60 天。如果需要更長時間保存, PreservCyt液基巴氏標本可儲存負20℃或以下,保存時間可長達24個月。如果標本采集并保存在Aptima采集運輸管, 在2-30℃它可儲存長達60 天。如果需要長期儲存,標本儲存負20或以下,保存時間也可長達24個月(Gen-Probe公司502182EN修訂版A,2011)。

Aptima檢測技術的優點是它不會發生交叉反應,其中包括其他高危型HPV或宮頸樣本中正常菌群和機會性病原 菌。AptimaHPV檢測主要用于21歲以上婦女ASC-US細胞學的反饋HPV檢測,30歲及以上婦女應用細胞學和HPV共同篩查。Aptima檢測方法具有高度的敏感性和特異性。在CIN3及其以上的病例中,該檢測方法雖具有與HC2一樣的敏感 性(95%),但比HC2法更加特異 [16]。

 6、Aptima HPV16、18/45基因分型試驗 

2012年10月12日,FDA批準Aptima HPV16、18/45基因分型試驗可用于臨床宮頸癌的篩查。

(1)用于21歲及以上ASC-US婦女,Aptima HPV檢查(14種高危HPV型)陽性者,評估HPV16、18/45存在否,結合細胞學檢查為臨床醫生提供處理的信息;

(2)對于30歲及以上細胞學和HPV聯合檢查高危HPV陽性者,尤其是細胞學陰性者,如HPV16、18/45陽性可直接轉診陰道鏡檢查。Aptima HPV16、18/45檢測原理與Aptima HPV檢測技術基本相似,靶向捕獲,轉錄介導擴增(TMA)靶向擴增和雜交保護實驗對擴增產物進行檢測分析。

 7、BD Onclarity? HPV Assay 檢測技術

BD Onclarity? HPV Assay HPV檢測技術由美國BD公司(Becton, Dickinson and Company)研發,是于2018年2月12日由FDA批準的最新HPV檢測方法。BD Onclarity? HPV Assay是采用BD Viper LT系統的一個的定性的自動檢測采集在BD SurePath的宮頸標本中的HPV分子診斷技術。是一基于由PCR擴增HPV的靶區DNA并結合核酸雜交用一次性檢測來檢查14種高危HPV。

該技術檢測基因型16,18,45并同時檢測其它的高危HPV包括31,33,35,39,51,52,56,58,59,66和68。該檢測系統經FDA批準可使用一下臨床指征:

(1)檢測21歲及21以上有宮頸細胞學ASC-US結果的女性的高危HPV基因型16,18和45決定21歲和21歲以上有宮頸細胞學ASC-US結果的女性是否推薦做陰道鏡檢查;

(2)對于30歲及以上婦女,和細胞學共同檢查;

(3)可以用于25歲及以上婦女宮頸癌的一線篩查來檢測高危HPV包括16和18。HPV16和18結果陽性者可推薦到陰道鏡檢查。但時這種檢測方法目前很少在臨床應用。

二. 宮頸細胞學HPV的檢出率和組織隨訪結果 

1、非典型鱗狀上皮細胞-不明確意義(ASC-US)

文獻報道的ASC-US的HPV檢出率變化差異很大,主要的原因是ASC-US細胞學診斷的低重復率和被研究人群的異質性。ASC-US TBS報告率大約為4%-10%,美國CAP2017年調查數據顯示實驗室中位數ASC-US率為5.4% (ThinPrep)、5%(Sure Path)。ATHENA研究報道在21歲極其以上的女性,HPV的檢出率是32.6%。其它研究的檢出率為31.2 – 34.5%之間。雖然美國CAP調查50%實驗室ASC-US HPV感染率為38.3%,30歲及以上婦女為30.7%,30歲以下婦女為51.3%。

ALTS的研究顯示HPV在ASC-US檢出率是57.1%,但現美國大多大醫院或臨床中心ASC-US婦女HPV陽性率在30-40%之間。ASC-US/HPV陽性婦女組織學隨訪CIN2+(CIN2及以上)檢出率變化較大,可為4.3-26.7%,大多數研究結果為5%-15%范圍內。UPMC  Magee婦女醫院一項大樣本研究3238例ASC-US/HPV陽性婦女半年組織隨訪CN2/3檢出率為7.3%,其中,各種HPV檢測方法組織隨訪CIN2/3結果稍有不同,HC2方法為8.7%,Cervista為4.6%,Aptima為7.3%。

2. 非典型鱗狀上皮細胞-不排除高級別(ASC-H)

在細胞學診斷中,ASC-H診斷的細胞學并不常見。雖有一定判讀標準,ASC-H的檢測率在不同的實驗室變化很大, 位于0.1 – 1.09%。美國CAP報道ASC-H中位數實驗室報告率為0.3% 。綜合122個實驗室ASC-H報告率為0.57%。HPV在ASC-H的檢出率變化范圍很大,為33– 85%。但大多數實驗室資料顯示ASC-H婦女HPV感染為50-60%,平均為55%。

ASC-H/HPV陽性婦女組織隨訪CIN2/3的檢出率為25-58%,平均為36%。UPMC Magee婦女醫院885例ASC-H/HPV陰性婦女平均29個月隨訪CIN2/3檢出率僅為1.6%。雖然ASCCP臨床處理指南建議對ASC-H病人應常規做陰道鏡檢查,但大多臨床試驗資料顯示HPV陰性ASC-H病人CIN2+病變檢出率很低,所以在美國很多實驗室對ASC-H病人常規反饋性檢測HPV,臨床醫生可根據HPV檢查全面平衡對病人的臨床處理。

3. 低級別上皮內瘤變(LSIL)

美國CAP2017年調查報告顯示 LSIL的流行率在ThinPrep是2.7%,SurePrep是2.8%。UPMC Magee婦女醫院LSIL報告率為3.4%。北加利福尼亞Kaiser Permanente (KPNC)的調查表明HPV在LSIL在30及其以上的女性的檢出率是83.5%。 ALTS 結果顯示是82.9%。Magee婦女醫院LSILHPV陽性率為74-80%。HPV在20歲以下的年輕女性可高達92%,以后隨著年齡的下降而漸漸降低??傮w而言大多數研究報告顯示LSIL婦女HPV陽性率為70-80%之間,平均為75%。LSIL/HPV陽性婦女CIN2/3檢出率為10%-20%,平均15%UPMC最近一項研究顯示1011例LSIL婦女半年組織隨訪CIN2/3檢出率為8.7%。HPV陽性組為10.2%,而HPV陰性組僅為2.8%。

4. 高級別上皮內瘤變(HSIL)

2017年美國CAP實驗室調查顯示HSIL的TBS細胞學報告率中位數為0.4%,匹茲堡醫學中心Magee婦女醫院HSIL報告率為0.5%,1226例HSIL婦女HPV陽性率為94%??傊?,細胞學HSIL婦女HPV陽性率應大于90%。如果小于90%就需考慮是否高報HSIL或HPV檢查方法有問題。細胞學HSIL婦女組織學隨訪CIN2+病變檢出率大約為50-70%,其余為CIN1或陰性。主要原因包括婦科醫生陰道鏡取樣不佳,病理醫生過高報HSIL或者病變較小而消退。

5. 非典型腺細胞(AGC)

在細胞學判讀中AGC的報告率介于0.1%-0.8%,美國CAP2017年調查AGC實驗室報告中位數為0.2%。UPMC Magee婦女醫院AGC報告率較高為0.6%。在細胞學為AGC的婦女HPV的檢出率為20 – 30%。Kaiser Permanente (KPNC)的調查表明30歲及其以上的婦女HPV的檢出率是21.3%。UPMC Magee婦女醫院報道細胞學為AGC的婦女 HPV 檢出率為24.3% - 27.7%。AGC婦女組織隨訪70-80%為陰性結果。UPMC Magee婦女醫院3007例AGC病人隨訪結果顯示CIN2及以上病例(包括宮內膜和轉移癌)為15%,宮頸AIS或浸潤性腺癌為2%,美國Kaiser1422例婦女CIN2+病例為16.7%,而實驗AIS或浸潤性腺癌為1.6%。

雖然對于AGC婦女ASCCP指南并不推薦做HPV檢測,但AGC/HPV陽性婦女組織隨訪宮頸呈高級別鱗病變為17%-34%,AIS以上腺病變可達7%-28%,而AGC/HPV陰性婦女宮頸高級別病變小于2%,所以AGC婦女HPV感染狀態對于臨床處理具有參考價值。

6. 陰性宮頸細胞學(NILM)

陰性宮頸細胞學(NILM)HPV在Pap細胞學陰性的女性的流行率變異很大,1% - 35.4%的范圍。HPV在30及其以上的女性的檢出率是介于3.4% - 8.2%。匹茲堡醫學中心Magee婦女醫院報道陽性細胞學Pap30歲以上的女性病人其HPV檢測率為在30歲以下的年輕女性為8.0%, 而30歲以上的女性1.9%高。ATHENA結果顯示HPV在Pap細胞學陰性的女性的檢出率是6.7%。

細胞學陰性文獻報道細胞學陰性/HPV陰性婦女隨訪結果差異很大,除了檢查方法和人群不同外,隨訪時間長短也有關系。

單次HPV陽性Pap細胞學為陰性的女性12個月的組織學隨訪CIN3+的風險是0.8% - 4.1 %。KPNC的調查結果是2%hrHPV陽性Pap細胞學為陰性的女性在10年內2%發展成CIN2+. 如果是HPV16或者HPV18陽性的話,38%發展成CIN3+. 匹茲堡醫學中心Magee婦女醫院的一項大型研究顯示,HPV陽性Pap細胞學為陰性的女性在2年間的CIN2+為2.4%。 ATHENA的研究資料表明HPV16或/和HPV18陽性的Pap細胞學為陰性的女性患CIN3+的絕對風險是9.8%。  

三.小結

經FDA批準的用于宮頸細胞學標本的HPV檢測方法目前有7種。它們在臨床的應用日益廣泛。HPV檢測作為非典型鱗狀上皮細胞的反饋檢測,病人的分流管理30歲及以上婦女共同篩查,甚至宮頸細胞學標本的一線篩查發揮著越來越重要的角色,雖然在美國HPV一線篩查很少應用于臨床各種HPV檢測方法都有其特點,特異性和敏感性略有不同,但無論是DNA或mRNA檢測方法在宮頸癌篩查中其主要作用是檢測HPV存在與否,并非哪一種方法就一定是檢測HPV持續感染狀態或致癌基因等。充分了解這些HPV檢測方法及其相應的臨床應用意義,對病人教育,醫療工作者的臨床應用都有著重要的意義。

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